Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают супернатант и промывают ячейки 200-250 мкл раствора СФБ-БСА. Повторяют промывку еще не менее одного раза.
Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, клетки ресуспендируют в 200-250 мкл раствора СФБ-БСА.
Суспензию клеток переносят в трубку, совместимую с имеющимся оборудованием для поточной цитометрии, и проводят дальнейшее разбавление добавлением СФБ для обеспечения подходящей скорости потока.
Немедленно приступают к измерению медианной интенсивности флуоресценции в поточном цитометре. Регистрируют не менее 10000 событий без гейтинга, но с исключением шумов.
С использованием медианной интенсивности флуоресценции в области линейности кривой зависимости отклика от дозы оценивают активность испытуемого препарата обычными статистическими методами (5.3).
2.7.14. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕННОЙ (ИММУНОГЕННОЙ) АКТИВНОСТИ ВАКЦИНЫ ГЕПАТИТА А
Количественное определение вакцины гепатита А производят либо in vivo, путем сравнения ее способности приводить в данных условиях к образованию специфических антител у мышей с такой же способностью препарата сравнения, либо in vitro, путем иммунохимического определения содержания антигена.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VIVO
Испытание на мышах, описанное ниже, приводится в качестве примера подходящего для данной вакцины метода; могут использоваться и другие методы с подтвержденной достоверностью.
Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей подходящей линии из одной партии, возрастом около 5 недель. Используют животных одного пола. Животных делят не менее чем на семь равных групп; количество мышей в группе должно быть подходящим для выполнения требований испытания.
Определение антигенной активности испытуемой вакцины. Готовят не менее трех серийных разведений испытуемой вакцины и соответствующие разведения препарата сравнения с использованием раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, содержащего алюминийсодержащий адъювант, используемый в вакцине. Каждое разведение назначают одной из групп мышей, каждой из которых
вводят подкожно не более 1,0 мл этого разведения. Контрольной невакцинированной группе вводят подкожно такой же объем раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, содержащего адъювант, используемый в вакцине. Через 28-32 дня всех животных анестезируют и производят забор крови. Индивидуальные сыворотки хранят отдельно друг от друга. Выполняют количественное определение специфических антител к вирусу гепатита А в индивидуальных сыворотках, используя подходящий иммунохимический метод
(2.7.1).
Вычисления. Вычисления проводят обычными статистическими методами, используемыми для количественных определений с конечным числом возможных результатов (5.3).
Из распределения уровней реакции, измеренных для всех сывороток группы невакцинированных животных определяют максимальный ожидаемый уровень реакции невакцинированного животного в данном количественном определении. При получении отклика, превышающего этот уровень, у вакцинированного животного, его по определению считают результатом сероконверсии.
Производят подходящее преобразование (например, пробит-преобразование) процентной численности животных с обнаруженной сероконверсией в каждой из групп и анализируют данные в соответствии с моделью параллельных линий логарифмической зависимости дозы от отклика. Активность препарата определяют относительно препарата сравнения.
Условия достоверности. Результаты испытания являются достоверными,
если:
- как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, ED50 заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными животным,
- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности,
- границы доверительного интервала относительной активности находятся между 33% и 300% от оцененного значения активности.
Требования к активности. Верхняя граница доверительного интервала (Р = 0,95) оцениваемой относительной активности должна быть не менее 1,0.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VITRO
Выполняют иммунохимическое определение (2.7.1) содержания антигена с критериями приемлемости, валидированными в сравнении с испытанием in vivo. Критерии приемлемости для данного препарата сравнения подлежат утверждению компетентными органами с учетом данных валидации.
2.7.15. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ ГЕПАТИТА В (RDNA)
Количественное определение вакцины гепатита B (rDNA) производят либо in vivo, путем сравнения ее способности приводить в данных условиях к образованию специфических антител против поверхностного антигена гепатита В (HbsAg) у мышей или морских свинок с такой же способностью препарата сравнения, либо in vitro, путем иммунохимического определения содержания антигена.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VIVO
Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей из одной партии, возрастом около 5 недель. Используемая в данном испытании линия мышей должна обеспечивать получение существенного уклона кривой зависимости отклика от дозы в отношении антигена; подходящими являются мыши гаплотипов H-2q и H-2d. Также могут использоваться здоровые морские свинки из одной партии с массой тела от 300 до 350 г и возрастом около 7 недель. Используют животных одного пола. Животных делят не менее чем на семь равных групп; количество в группе должно быть подходящим для выполнения требований испытания.
